Technologie RCA

RCA : Clonage non-biaisé pour le séquençage d'anticorps

Le séquençage des parties variables d’un anticorps monoclonal est un travail long et laborieux, du à la nature intrinsèque extrêmement variable du répertoire immunitaire. Classiquement, de multiples réactions d’amplification par PCR sont nécessaires pour sélectionner un couple d’amorces nucléotidiques capable d’amplifier efficacement le domaine variable d’intérêt. Les anticorps monoclonaux obtenus par la technologie des hybridomes murins possèdent un niveau de complexité supplémentaire pour leur séquençage, lié à la présence d’un pseudogène IGKV dérivant de la lignée de myélome utilisée comme partenaire de la fusion cellulaire. Ce pseudogène est souvent amplifié lors des réactions de PCR, obligeant ainsi à des étapes ultérieures de sous-clonage des produits PCR pour pouvoir identifier les séquences productives fonctionnelles.

 

Au CIPF, nous avons conçu et développé une nouvelle méthode de séquençage des parties variables d’anticorps, dont les étapes d’amplification sont basées uniquement sur la connaissance  des parties constantes (isotype) des anticorps d’intérêts. En exploitant les principes de l’amplification par cercle roulant (ou rolling circle amplification - RCA), propre à certaines ADN polymérase de bactériophage, seules trois amorces nucléotidiques sont nécessaires pour amplifier les parties variables d’un anticorps. En choisissant stratégiquement les sites d’hybridation des amorces au niveau des parties constantes, l’amplification du pseudogène est évitée. Ainsi, l’application de cette nouvelle méthode de séquençage par RCA permet de réduit de 75 % le nombre d’étapes d’amplification et par 35 % les coûts associés à cette détermination de séquence.

 

technologie RCA du Centre d'Immunologie

 

Un avantage supplémentaire lié à cette nouvelle technique de séquençage est la détermination de la région L-PART couvrant le peptide signal et la séquence 5’ non-traduite des chaines lourde et légère d’anticorps. Ces informations sont importantes pour la production ultérieure de ces anticorps par génie moléculaire. Cette technique peut également être appliquée pour la génération de banques d’anticorps complets pour une présentation à la surface des cellules eucaryotes.